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猪器官移植新突破:CRISPR技术解决了「猪内源病毒」

现代医学研发出器官移植的技术,但是材料却远不足够,等待捐赠器官的病患大排长龙,大多数人一生都等不到。人类是动物,器官是肉做的,其他动物也是,那么何不借其他动物的器官一用?

用 CRISPR-Cas9 成功消灭猪的内源反转录病毒,培育出基因改造猪,上了当期《Science》封面。图/取自《Science》封面

缺乏移植器官,借猪的一用

将其他生物的组织、器官,移植到人类身上,有个酷炫的名词“Xenotransplantation”,翻译作“异种器官移植”。猪是已知各种动物中,最适合作为人类器官的来源,然而要将猪的器官,如心臟移植进人体,仍有重重难关有待克服,目前还没有成功案例。

异种器官移植至少有三大潜在问题。第一,免疫排斥。以猪举例,儘管猪已经是最适合的移植对象,但毕竟人猪殊途;将猪的器官移植进人体后,人类免疫系统会将其视为外来者(也真的是外来者)攻打,导致手术失败。第二,生理不相容。也就是猪的器官,无法在人体顺利运转。[1]

  • 延伸阅读:动物器官移植到人身上,异种移植可行吗?

靠着基因改造猪与药物控制,以上两个问题,都已达到相当程度的改善。而最近发表在《Science》期刊的论文,则是针对另一个问题,有了令人振奋的进展。异种器官移植的第三个潜在问题是:猪病毒感染。[2]

“借”我的器官用?哼!图/取自《Science》新闻〈CRISPR slices virus genes out of pigs, but will it make organ transplants to humans safer?〉

住在基因组中的古老病毒

等等,这问题很好解决吧!假如猪带有病毒,那么只要让等待供应器官的猪,从胚胎开始就养在无菌环境中,不就能避免牠们长大以后,将病毒传染给人类吗?

问题当然没有这么简单,别误会,这里的“猪病毒”不是住在猪身体内的病毒,而是躲在猪的基因组中,以 DNA 序列方式存在的内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,缩写为 PERV)。这些病毒就是猪本身的遗传序列,不可能直接外加药物消灭。

事实上,人类跟猪一样,基因组中也存在不少这类病毒。在人类的演化歷史上,基因组不断更替,曾有许许多多外来的转位子(transposon)插入我们祖先的 DNA 序列,也顺便引进不少病毒,后来成为基因组的一部份。(人类基因组广义看来,共超过 40% 是由各式转位子所引进,来自病毒的只占相对比例,很低的一小部分)

经过长期的演化淘汰,能在基因组中留存下来的病毒,都成为“内源性”的病毒,属于跟随细胞正常复製程序的固定成员,绝大部分时候安份守己。我们的免疫系统,除了抵抗外来的入侵者以外,另一重要任务,正是防范这些原本的病毒遗传物质,哪时候又挣脱枷锁,跑出来作乱。

人的基因组中,有人的内源性反转录病毒,我们的遗传与免疫体系可以压制它们。猪的基因组中也有猪的内源病毒,它们在猪的体内受猪控制,当然对猪不成问题,然而,假如把猪的器官移植给人类,猪的病毒在陌生的人体环境中,很可能成为摆脱拘束器的杀人狂魔。(反过来说,把人类器官移植给猪,应该也会发生类似的事,不过此一状况大概没有机会上演)

将猪与人的细胞株共同培养,猪的 PERV 会转移到人类的细胞株,而且愈久愈严重。图/取自 ref 2

猪的内源病毒会传染给人

怎么解决?既然病毒就是猪基因组的一部份,不可能以外加药物处理,那么只能直接编辑猪的基因组,先把 PERV 序列消灭。

不过,目前仍缺乏将猪器官移植给人的信息,猪的病毒在人体作乱,想来儘管严重,却纯属假说,真的值得大费周章去改造 DNA 培养基改猪吗?新发表的论文,首先进行了一系列实验,证实 PERV 的病毒危机并非危言耸听。

猪的内源性反转录病毒可分为三种:PERV-A、PERV-B、PERV-C,在猪的基因组中合计有 62 个之多。将源自猪的 PK15 细胞株,与来自人类的 HEK293T 细胞株一起培养,过了很多代以后,人类细胞的基因组中也能侦测到 PERV(有 A 有 B,没有 C),而且数目随代数增加愈来愈多,证实 PERV 确实有能力由猪的细胞向人入侵。

将带有 PERV 的人类细胞株,与未接触过猪细胞株的人类细胞共同培养,PERV 能够转移到新的人类细胞。图/取自 ref 2

为了测试 PERV 在人体的转移能力,实验团队接着将受到 PERV 感染的人类细胞株,与新的人类细胞株共同培养。结果是,即使从未接触过猪的细胞,只要样本中存在来自猪的 PERV,它仍然能传播给新的人类细胞。

儘管以上只是非常简单的体外测试,与免疫系统存在、复杂的人体环境大不相同,不过仍足以证明跨物种的猪病毒感染,是器官移植时不可忽视的风险。毕竟,移植时为了降低排斥反应,势必会先用药物抑制人体的免疫作用,这正是病毒转移的良机。

用 CRISPR-Cas9 改造猪的胚胎纤维母细胞,消灭基因组上头的一大堆 PERV,创造出不会表现 PERV 产物的改造猪细胞。图/取自 ref 1

器官移植新希望-没有内源病毒的猪宝宝

靠着近来当红的基因编辑工具 CRISPR-Cas9,研究团队之前已经成功消灭过猪细胞株的 PERV 序列 [3]。不过,假如目的是器官移植,那么就要改造猪的初级胚胎纤维母细胞(primary procine fetal fibroblast,这边用的型号称作 FFF3),才能培育长大后用于移植的个体。

FFF3 细胞的基因组上,共有 25 处活跃的 PERV,都是需要以 Cas9 精准打击、根除的目标。两款 gRNA 被用于导引 Cas9 前往攻击,然而初步结果显示,战况非常惨烈;看起来,大规模同时攻击基因组上的许多部位,会使得自我毁灭机制啟动,细胞被改造成功,然后它就死掉了。

把经改造后失去 PERV 感染性的胚胎细胞,植入孕母母猪,生下没有 PERV,有望用于器官移植的小猪。图/取自 ref 1

像最后一战(Halo)士官长般如此强悍,经歷全身改造后仍活跳跳的细胞,毕竟极为少数。为了克服此一问题,研究者调配了“鸡尾酒”一起餵食细胞,也就是在基因改造同时,再加上p53 inhibitor、pifithrin alpha (PFTa)、basic fibroblast growth factor (bFGF),让受到剧烈衝击的细胞能继续活着,不要想不开自杀。

修正后的作法非常成功,研究团队终于获得基因组不含 PERV 的乾净 FFF3。靠着千辛万苦后得到的细胞,如今已经培育出 15 位不会表现 PERV 的健康小猪宝宝,直到论文发表之际,最老的已长到 4 个月大。

将猪的器官移植给人,目前离那一天仍为时尚早。不过这回的基因改造猪仍是又一大突破,让我们离目标更进一步,也让学界有了更多信心。[4]另一方面论文也指出,采用 CRISPR-Cas9 进行基因改造的同时,搭配这回的反自杀鸡尾酒配方,能十分有效地强化编辑效率,增加成功率,未来或许有很宽广的发展空间。

参考文献

  1. Advances in organ transplant from pigs
  2. Niu, D., Wei, H. J., Lin, L., George, H., Wang, T., Lee, I. H., … & Lesha, E. (2017). Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science, 357(6357), 1303-1307.
  3. Yang, L., Güell, M., Niu, D., George, H., Lesha, E., Grishin, D., … & Cortazio, R. (2015). Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science, 350(6264), 1101-1104.4.
  4. Scientists grow bullish on pig-to-human transplants

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