病毒感染有可能导致癌细胞生长?致癌基因是如何被发现的?

文/陈弘之

洛克菲勒大学的Founder’s Hall source:wikipedia

1911年,洛克菲勒医学研究所(洛克菲勒大学前身)的裴顿.劳斯(Peyton Rous)教授发表了一篇论文,带给了生医界一个新的想法:

病毒感染有可能导致癌细胞生长。

根据论文的实验方法,劳斯教授取出了母鸡的乳癌细胞,并经研磨、离心和过虑后,将滤液注入健康的母鸡体内,发现实验的母鸡有很高的比例都诱发癌细胞的生长;又因为实验使用过滤器材的孔径比细菌还小,所以癌症的诱发可能是经由滤过性病毒传染。

裴顿.劳斯(Peyton Rous)教授。图/wikimedia commons

但劳斯教授的论文当时并没有立即在学界引起广大的迴响,一直要到 1960 年代,科学家才终于发现和鼠类乳癌与白血病(血癌)息息相关的 RNA 病毒。特定品系的实验鼠有很高的比例会罹患相同的癌症,而且还能在电子显微镜中观察到 RNA 病毒从癌细胞表面出芽生长;很显然的,这种 RNA 病毒会经由垂直传染,而致癌因子在不妨碍细胞基本机能的情况下由亲代传给子代,如此造就了高比例的同品系实验鼠产生相同的癌症。

但究竟癌症传染的机制为何?致癌的机转又是怎么一回事?是否了解了致癌的病毒就可以一劳永逸地治疗癌症?本文将带领读者看看科学家们是如何一步一步的回答这些问题。

反转录病毒的发现

既然先前观察到从癌细胞表面出芽生长的是以 RNA 为遗传因子的病毒,很直观的就会认定造成垂直遗传的致癌因子就是该病毒的 RNA,但科学家发现这种 RNA 病毒的生活史当中存在着合成的病毒 DNA,那么致癌的因子到底是病毒的 RNA 还是 DNA,就需要进一步的验证了。

霍华德.特明(Howard Temin)教授。图/BY Associated Press@wikimedia commons

威斯康辛大学的霍华德.特明(Howard Temin)教授提出了一个可能:

  1. 这种 RNA 病毒会先以 RNA 为模板合成互补的 DNA 序列
  2. 合成的病毒 DNA 会嵌入宿主的 DNA 中
  3. 嵌入后的病毒 DNA 成为 RNA 合成的模板并进行病毒复製

虽然看起来合理,但这样的假说在当时面临一个很大的问题:以 RNA 作为模板合成 DNA”在整个生物界中是前所未闻,也和弗朗西斯.克里克(Francis Crick)所提出的细胞中心假说(central dogma/遗传讯息是由 DNA 到 RNA 到蛋白质)相违背,更重要的是具有以 RNA 为模板的 DNA 合成酶从来就没有被发现过!

但就在 1970 年,麻省理工学院的戴维.巴尔的摩(David Baltimore)教授发现了催化以 RNA 作为模板合成 DNA”的酵素。

巴尔的摩教授选择鼠类白血球增生性肿瘤病毒(Rauscher mouse leukemia virus/R-MLV)与劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus/RSV)两种 RNA 病毒来做实验,他将病毒株纯化并加入镁离子、氯化钠、二硫苏糖醇(dithiothreitol/可避免酵素中的硫醇根氧化)和去氧核苷三磷酸(dNTP/其中 dTTP有做放射线标定)创造出有利于 DNA 合成的培养环境,结果产生了分子量大且具有放射性的 DNA 产物。

戴维.巴尔的摩(David Baltimore)教授发现了催化“以 RNA 作为模板合成 DNA”的酵素。图/wikimedia commons

为了证实该DNA的合成是源自于病毒的 RNA,巴尔的摩教授又更进一步做了两组对照的实验:

  • ※已知仅 RNA 会被胰核糖胰核酸酶(pancreatic ribonuclease)破坏,DNA 则否

1-1一般病毒培养进行 DNA 合成做为实验对照组

1-2病毒培养的环境中加入胰核糖核酸酶

2-1静置纯化过的病毒株 20 分钟再进行DNA合成反应

2-2预先用胰核糖核酸酶处理纯化的病毒 20 分钟再进行DNA合成反应

经过与对照组 1-1 产率的比较后发现,1-2 在加入胰核糖核酸酶会使得 DNA 产物下降,2-2 预先用胰核糖核酸酶处理的病毒株其DNA 产率更低,2-1 单纯静置 20 分钟后则还有相当的产率。

此实验结果证成了以 RNA 作为模板合成 DNA”的假说,而这种仅在特殊 RNA 病毒上发现的“以 RNA 为模板的 DNA 合成酶后来被称作反转录酶;反转录病毒在将 RNA 反转录成 DNA 后,病毒的 DNA 会嵌入宿主的DNA,经由转录、转译合成病毒的蛋白质,使得宿主细胞病变(例如癌化),也因为病毒带有的致癌基因在感染后已成为宿主 DNA 的一部份,所以当生殖细胞也受到病毒感染时,减数分裂后的配子也就理所当然的带有病毒的致癌基因,造成癌症的垂直传染。

Src 基因的发现

了解了病毒如何将致癌基因带给宿主后,科学家的下一个目标就是要研究到底反转录病毒中的哪一段基因具有致癌性。1970年代,某些突变后的致癌性反转录病毒被发现,这种突变的反转录病毒虽然可以感染宿主,却没有致癌能力,显示致癌与否的关键就存在于变种与原病毒株之间的基因体差异。

加州大学旧金山分校的哈罗德.瓦慕斯(Harold Varmus)、米高.毕晓普(J.Michael Bishop)和多明尼克.施特赫林(Dominique Stehelin)教授设计了以下的实验,用鸟类白血病性肉瘤性病毒(avian leukosis-sarcoma virus)找出了一种致癌基因 src(命名由来为肉瘤 sarcoma):

  1. 分离出基因突变后不具致癌性的反转录病毒并取其 RNA,经基因分析和比对,发现其亡失了10-20%的基因体。
  2. 取出原病毒株的完整 RNA,在反转录酶的催化下合成单股的互补 DNA(cDNA),并用放射线标定 DNA产物。
  3. 将突变病毒的 RNA 与具有放射性的 cDNA 进行碱基配对,没有 RNA 配对的 cDNA 为突变病毒亡失的基因体,含有致癌基因。
  4. 用管柱层析法分离出带有致癌基因的 cDNA,并命名为 cDNAsrc。

从病毒中找到 cDNAsrc之后,科学家又有了新的发现:原来在许多种健康的鸟类(包括:鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和鸸鹋)细胞当中也可以找到和 cDNAsrc 碱基互补的 DNA 序列,这表示反转录病毒所带的致癌基因,很有可能是鸟类原有的 DNA 序列,只是在反转录病毒的生活史中,和嵌入的病毒 DNA 一同被转录,并且成为新的病毒基因体的一部分,而带有 src 基因的病毒在感染后可以促使宿主细胞大量分裂(癌化)所以在演化过程中被保留了下来。

许多种健康的鸟类(包括:鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和鸸鹋)细胞当中也可以找到和 cDNAsrc 碱基互补的 DNA 序列。图/pixabay

但更惊人的还在后头,科学家接着发现源来不只是鸟类,所有脊索动物门的动物细胞内都能找到和 cDNAsrc 互补的 DNA 序列!既然 src 基因存在于所有的脊索动物,则其必然具备某种重要的细胞生理机能。所以科学家接着所要解决的问题是:

  1. Src 基因所转译的蛋白质具有什么细胞机能?
  2. 嵌入病毒src基因(v-src)后的宿主细胞究竟产生了怎样的病变?

Src基因的细胞生理机能

科罗拉多大学的雷蒙.艾瑞克森(Raymond Erikson)教授率先找出 src 基因的功能。

他从感染劳斯肉瘤病毒(RSV)的实验动物中萃取出专一的抗体,并使用免疫沉淀法分离出 src 基因转译出的蛋白质,经过分析,这种蛋白质的分子量约为 60,000 道尔顿,故称之为 pp60src;又将受感染的动物细胞进行固定和组织切片后,再用铁蛋白(ferritin)标定与 pp60src 结合的抗体,发现 pp60src 皆附着于细胞膜的内侧面,尤其集中在细胞的隙型连结(gap junction)。

艾瑞克森教授接着将 pp60src 与抗体的复合物加入含有 [32P]ATP 的培养液中,放置一段时间后,发现 ATP 上带有放射性的磷酸根被转移到与 pp60src 复合的抗体的重链(heavy chain)上,显然 pp60src 具有催化蛋白质磷酸化的功能,而这也是科学家第一次了解到致癌基因的致病机转:

细胞生理的控制很大一部分倚靠着蛋白质的磷酸化/去磷酸化,如 pp60src 在接受到细胞外的分子讯息后活化,磷酸化下游蛋白质,下游蛋白质再进行一连串的讯息传递与放大,最后活化转录因子,产生蛋白质并改变细胞生理状态;当磷酸化/去磷酸化没有受到精准的调控,细胞内复杂的代谢途径就会受到影响,若其中牵涉到细胞生长的讯息传递途径,就可能造成细胞不正常的增生,也就是细胞的癌化。

Src 基因的磷酸化功能虽有重要的生理意义,但在之前学界中都没有被发现,这是因为不同于一般的磷酸化酵素会作用在蛋白质序列中的丝胺酸(Serine)和苏胺酸(Threonine)上,pp60src则是将磷酸根转移到酪胺酸(Tyrosine)上,而细胞中磷酸化丝胺酸(phosphorylated serine)和磷酸化苏胺酸(phosphorylated threonine)的数量大概是磷酸化酪胺酸(phosphorylated tyrosine)的3,000 倍,所以早期并没有发现酪胺酸磷酸酶的存在。

经过比较后发现,受到劳斯肉瘤病毒感染的动物其癌细胞内磷酸化酪胺酸的数量约为一般动物细胞的 8 倍,是 v-src 的高度磷酸化表现造就了宿主细胞的不正常增生。

核苷酸序列的改变―另一种致癌的机制

图/wikimedia commons

正当科学家们高兴找到的 src 的致癌机转,以为克服了癌症的难关,麻省理工学院的罗伯特.温伯格(Robert Weinberg)教授提出另一种不同于病毒感染的致癌机制:

核苷酸序列的改变会活化致癌基因并造成细胞癌化。

其实验过程简单整理如下:

  1. 用 3-MC、BP 等致癌化学物使得实验鼠细胞癌化,产生15种不同的细胞株(cell line)
  2. 萃取出不同细胞株的 DNA 并转染纤维母细胞(fibroblast/NIH3T3)
  3. 观察转染后的 NIH3T3 是否有癌化的征兆,产生凝块(clump)
  4. 萃取一般动物细胞 DNA 作为对照组,转染 NIH3T3 观察是否造成细胞癌化

结果在 15 种细胞株当中,有 5 种萃取出的 DNA 在转染后会造成 NIH3T3 的癌化,而一般动物细胞则没有造成癌化的能力,显然一开始的化学分子操作改变了细胞的 DNA 序列,并使之拥有造成其他细胞癌化的能力:

病毒感染不再是唯一的致癌途径。

在 1981 年,科学家改采用人类的癌细胞进行相同的实验,在 26 种膀胱癌(bladder carcinoma)细胞株当中,有两种萃取出的DNA(EJ和J82)具有使细胞癌化的能力,再经过一番研究,EJ 和 J82 的细胞株当中并不含病毒嵌入的 DNA 序列,可见人类本身的DNA当中就存有某种致癌基因,当该基因被(不正常)活化的时候,便会造成细胞的癌化。

于是科学家的目光开始聚焦在找出人类 DNA 序列中的致癌基因,很快的在 1982 年就从 EJ 和 J82 中分离出具有致癌能力的 DNA 片段,而经过 DNA 比对,该序列和哈威肉瘤病毒(Harvey sarcoma virus)所带有的致癌基因(ras)基本上是一致的(仪器检测不出差异);科学家便推测:

人类的 ras 基因在某种机制的活化(突变)后,或许和哈威肉瘤病毒造成的癌化有相同的致病机转。

在同年年底,科学家分析膀胱癌细胞突变后的ras基因的核苷酸序列后发现,ras 的突变仅仅是由于单一的碱基置换:

序列中有固定一个鸟嘌呤(Guanine)被换成了胸腺嘧啶(Thymidine),而该点突变改变了密码子的遗传讯息,使得原本 ras 蛋白质上的甘胺酸(Glycine)被缬胺酸(Valine)取代。

这又与哈威肉瘤病毒所带有的 ras 基因有相同的特征:

受病毒感染的细胞转译出的 ras 蛋白质当中的同样一个甘胺酸,被精胺酸(Arginine)取代,显然此甘胺酸对于 ras 蛋白质的构形与功能有重大的影响。

更有甚者,由于哈威肉瘤病毒感染后会导致鼠类的肉瘤(sarcoma/癌细胞起源于软组织)与白血病(leukemia/癌细胞起源于骨髓),与膀胱癌(carcinoma/癌细胞起源于上皮组织)的癌症分类并不同,这是因为 ras 属于小分子量 GTP 水解酶(small GTPase/ small G protein),调控着细胞内的蛋白质讯息活化,所以当 ras 被大量转译容易造成细胞癌化,而 ras 也是科学家首次发现会造成不同种类癌症的单一基因突变。

为了攻克癌症这个难题

为了攻克癌症这个难解的疾病,科学家们从癌症的起源着手,发现了有致癌性的反转录病毒,之后又了解到许多致癌基因本来就存在于人类的 DNA,像 src 和 ras,所以又将它们称做原致癌基因(proto-oncogene),当不正常表现时会造成细胞的癌化。

但癌症的发生机转非常复杂,每当科学家找出一种致癌途径却总发现没能穷尽所有可能,于是即使研究向前了一步也不得停下追寻答案的脚步,也是在研究癌症的过程中,渐渐拼凑出细胞内各种讯息活化的途径,当我们现在看着一张张清楚的细胞机制图时,可别忘了科学家们努力不懈的斑斑足迹啊!

  • 翻译并改写自 Cell Biology, Gerald Karp 7th edition P.694-697 The Discovery of Oncogenes
  • 本篇文章已取得授权编译,若有疑虑或是希望取得授权请联络Wiley Press。
  • 本书亦有中文版本:细胞生物学-结合了理论与实验,带您一窥生命的奈米世界,合记图书出版社

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