韩春雨公开新版实验方法

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整理 赵维杰 张帅琰

吴兰 三个月前,河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文(F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016)。文章介绍了一种新型的基因编辑方法,迅速引起广泛关注。 然而,随着时间推移,研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。8月2日,《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。8月8日,韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法,其中补充了数项应特别注意的问题。

(新版实验方法全文,可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载)。

新版实验方法具体分为细胞培养、质粒/gDNA 共转染,以及基因组提取三个部分。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods(详见 http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information)。

新实验步骤有几处改变:
1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。
2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢,换液时要小心操作”的小提示。
3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后,补转一次 gDNA;旧版方法中只提及了“24小时”。
4 旧版方法中,溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE(5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0),而新方法中则变更为水(pH 8.0)。

最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中,EDTA 再次出现:其中一条注意事项专门提到,应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。

这四条注意事项分别是:
1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感,在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。
2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子,在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。
3 转染试剂 Lipofectamine® 3000会阻碍 gDNA 进入细胞,不能用于转染。可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。其他转染试剂是否可用还有待验证。
4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理,处理体系如下:(体系略)处理后的 gDNA 无需再次纯化,直接用水(pH 8.0)稀释至300 μl,终浓度10 nM。

据 Nature报道,韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信,但他始终坚信自己的研究成果没有问题。Nature将喜爱茶叶、古琴,并且从未出国的韩春雨称为“隐士”,而今这位隐士不得不走上风口浪尖,直面质疑。 据新华网消息,河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验,并邀第三方证实。

为什么 NgAgo 会“不好使”?

NgAgo 之所以引起广泛关注,在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性,赋予了其可观的应用潜力。例如,NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性,与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比,NgAgo 理论上可切割的序列更多。其次,NgAgo 系统用以识别靶基因的先导物为 DNA(gDNA),与 CRISPR 使用的 gRNA 相比,易用性更强,成本更低。另外,NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的 GC 富集区域。 与此同时,NgAgo 系统也表现出一些劣势。NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ,这种先导物无法从质粒里表达获得,不能在靶细胞里产生,只能在细胞外合成后输入细胞内;研究者在执行基因编辑时,可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。并且,gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。 爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化,他表示,NgAgo 系统的目前的可重复性难题,无疑说明了这一系统的优化工作非常困难;他同时认为,NgAgo 系统难以优化的原因,可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在,以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。

已有9人声称 NgAgo 有效

自韩春雨2016年3月在线发表论文后,来自全世界的科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。调查发现,截至2016年8月8日,193名被调者中,各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象(indels and knock-in),100人声称无法观察到剪切,47人声称无法观察到基因插入。

附:NgAgo 可重复性问题事件节点
·2016年6月,网络上逐步有传言称,国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果,引起部分科学家的质疑。韩春雨在回复中表示,新系统刚出来都会“不好使”,他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定,等2.0版本出来会找专门机构免费发放。
·7月2日,方舟子公开质疑该实验的可重复性,NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵,韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应,称实验重复失败可能是由于支原体污染、试剂保存等问题。
· 7月28日,先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示,经进一步检测,该技术无法进行基因编辑。他表示,NgAgo 也许会奏效,但鉴于其不稳定性,它并没有 CRISPR 实用。
·7月29日,西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 (ISTT) 的同僚群发邮件,建议“放弃所有NgAgo相关项目”。与此同时,之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误;Jan Winter 同时表示,自己并不认可韩春雨此前做出的回应。
· 截至8月8日,爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复,其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象(indels and knock-in),100人声称无法观察到剪切,47人声称无法观察到基因插入。

·据新华网消息,河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验,并邀第三方证实。

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  • 水太深

    4年前 (2016-08-19)
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  • 即使没有作假,可能也无法重复....

    4年前 (2016-08-17)
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