新手指南:如何设计CRISPR实验进行基因组编辑

简介 CRISPR和CRISPR关联系统(CAs)是强大的基因编辑技术。最初被发现是在细菌体内特有的,内源CRISPR系统以RNA依赖的防御机制抵抗外来噬菌体DNA的入侵。细菌和古菌进化的自适应免疫防御,称为群集定期空隙短期复发性重复(CRISPR)/CRISPR关联(CAs)系统,使用短RNA可以直接降解外源核酸。

 

2013年,CRISPRcas9基因组编辑以其能使目标DNA双链断裂的能力被开发利用,是分子生物学中革命性的进展。本文涉及CRISPR实验设计的基础知识。

 

一.CRISPR的基本原理说明

2012年,Makarova等人将内源的CRISPR系统分为三类:I型、II型和III型。由内生型II系统改编和简化的CRISPR基因组编辑工具主要有以下组件构成:

1.Cas9:核酸内切酶,其作用是诱导基因组DNA双链断裂,允许基因或DNA序列的移除,以及在特定位点外源DNA的整合。

2.向导RNA(gRNA):这种RNA具有一段特殊序列,是Cas9结合所必须的,以及一个20个核苷酸的自定义间隔序列。

3.同源重组模板(可选):这是一个包含突变的DNA片段,用于引入同源区域。

 

二.CRISPR/Cas9基因编辑是如何进行的?

1.在同一细胞中表达gRNA和Cas9,形成gRNA:Cas9复合物以招募目标DNA序列,其位于上游的一个前

间区序列邻近基序(PAM),大多数Cas9酶识别PAM基序是依赖于NGG序列(一个任意核苷酸之后带有2个鸟嘌呤核苷酸)。

2.gRNA与目标DNA的结合是通过互补碱基配对原则,基因组目的序列和gRNA上的20个核苷酸的间隔

区识别。随后gRNA:Cas复合物上的Cas9酶切断基因组DNA,导致PAM序列后的DNA双链断裂。至关重要的是,Cas9不能消化DNA,除非DNA结合到gRNA上,因此具有系统特异性。

3.最后,通过内源非同源性末端接合(NHEJ)途径修复断裂,至此编辑过程完成。虽然这种DNA修复系统

是最有效的修复途径,但也容易出错,有时会有小的插入或删除,会导致移码,降低蛋白质产量。另一种选择是利用内生同源性定向修复(HDR)系统,通过提供同源重组模板,通常在需要引入目标突变时使用。

 

三.目标序列和gRNA注意事项:

1.在设计gRNA之前,确定你的目标DNA的精确序列,如果gRNA和目标DNA不同,则会降低效率。同

时,检查是否有物种特异性,细胞专一性,多态性。

2.接下来,确定所有PAM序列(NGG)在你的兴趣区域内。一旦确定,你可以在最佳的潜在目标区域进

行选择。

3.基于PAM的位置设计gRNA和HR模板(如果使用)。gRNA必须匹配目标DNA,同样重要的是,gRNA不

应该与任何其他的远离目标序列的基因组位点匹配。HR模板设计好之后克隆进载体中

 

四.CRISPR结构的转染和筛选

设计好gRNA和HR模板后,将Cas9质粒和gRNA及HR载体共转染至已选择好的细胞株中,可以使用脂质转染、电穿孔或显微注射等转染方法。

转染后,下一步即为筛选,可以通过限制片段长度多态性分析(RFLP),TIDE分析,测序技术或荧光激活细胞分选(流式细胞术)等方法进行。最优的筛选方法取决于你所做的修饰和所选细胞系。

 

五.Tips

最终,CRISPR基因组编辑实验的效率好坏,一部分在于计划,一部分在于运气。系统组件和Cas9的相互作用机制还不是很清楚。

使用高质量的完整DNA,确保没有RNA和其他污染物。

检查HR模板与Cas9/PAM的结合位点,这些位点有可能会导致模板降解。

对PAM位点进行筛选,通过沉默突变移除它们。

NGG替换为NAG是不起作用的,NAG是一个隐藏的PAM位点。

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